ginekolodzy w sanoku

Mózgowa komora serca ma w przeważającej mierze y-MyHC, w przeciwieństwie do ludzkiej komory, która ma głównie P-MyHR (24). Ponieważ izoformy MyHC wykazują znaczące różnice w aktywności aktywowanej aktyną-Mg-ATP-azy i kinetyce krzyżowej (25-29), różnice w składzie białek mięśnia sercowego mogą wpływać na odpowiedź fenotypową serca na zmutowane białka. W przeciwieństwie do myszy, przeważającą izoformą miozyny w mięśniu sercowym królika jest y-MysHC (30), który ma około 98% homologii z ludzkim białkiem a-MyHC (30, 31). Dlatego stworzyliśmy transgeniczny model królika dla ludzkiego HCM, poprzez ekspresję zmutowanego białka (3 -MyHC-Q403, o którym wiadomo, że wywołuje HCM u ludzi (32) w sercu. Fenotyp był praktycznie identyczny z fenotypem człowieka, mianowicie przedwczesna śmierć, przerost serca, rozregulowanie miocytów, zwłóknienie śródmiąższowe i normalna funkcja skurczowa. Metody Wszystkie protokoły użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Institutional Review Board w Baylor College of Medicine. Transgenes. Wcześniej sklonowane pełne (R403) dzikiego typu i zmutowane (Q403) pełnej długości (6 kb) ludzkie cDNA y-MyHC (33) wstawiono do miejsc restrykcyjnych SalI i Hindlll w dół do 7-kb 5. fragment mysiego genu y-MyheC (klon 32, uprzejmie dostarczony przez J. Robbins a [University of Cincinnati, Cincinnati, Ohio, USA]). Promotor 7-Kb-MyHC zawiera również pierwsze 3 nie kodujące egzony i odpowiednie introny genu a-MyHC. Ponadto fragment o wielkości 600 pb z 3. nieulegający translacji (UT) fragment ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) został umieszczony 3. do ludzkich cDNA y -MyHC w celu zwiększenia stabilności mRNA (Figura 1). Figura 1Schematyczna ilustracja konstruktów transgenu typu dzikiego ((3-MyRC-R403) i zmutowanego (a-MyHC-Q403). Ludzkie cDNA dzikiego typu i zmutowane klonowano 3. do mysiego mutanta 7-kb. -MyHC. 600-bp 3. nieulegający translacji fragment (UT) ludzkiego hormonu wzrostu (hGH) również umieszczono w dół od cDNA. Generacja transgenicznych królików. Całe transgenów (promotor a-MyYC + cDNA y-MysHC + 3. UT hGH) uwolniono z wektora przez trawienie endonukleazą restrykcyjną Notl, rozdzielono za pomocą elektroforezy żelowej, oczyszczono z wektora i rozcieńczono w buforze TE w stężeniu 100 ng /. L. Procedura produkcji transgenicznych królików była podobna do tej opisanej przez Knight et al. (34). W skrócie, w dniu 4, króliki dawcy zygoty wstrzyknięto podskórnie 50 IU ciężarnej klaczy gonadotropiny do wywołania nadrzepulacji. Samice królików dawców następnie kojarzono z samcami królika w celu wytworzenia zapłodnionych zarodków. Dziewiętnaście godzin później, pierwszego dnia, zarodki pojedynczych komórek zostały wypłukane od królików dawców. jajowody w pożywce składające się z PBS uzupełnionego 20% FBS przy pH 7,4. Przedjądry zapłodnionych zygot były mikroinieklizowane oczyszczonymi zlinearyzowanymi konstruktami transgenu a-MyHC. Samice biorców otrzymały pseudopregnat przez dożylne wstrzyknięcie 150 jm przewlekłej gonadotropiny i łączenie się z wazektomizowanymi jałowymi męskimi królikami 2 dni przed implantacją. Po mikroiniekcji zarodki 1-komórkowe wszczepiano przez fimbrialny koniec jajowodów królików biorcy pod znieczuleniem ogólnym. U królików-biorców obserwowano objawy ciąży i urodzenia królików przez 2 miesiące po wszczepieniu. Identyfikacja transgenicznych królików i ustalanie linii transgenicznych. Nowonarodzone króliki były badane pod kątem obecności transgenu DNA metodą PCR i Southern blotting. DNA ekstrahowano z biopsji ucha za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (Qiagen Inc., Valencia, Kalifornia, USA). W oparciu o sekwencję transgenu (31) zaprojektowano zestaw starterów oligonukleotydowych (przedni 5. TGAGCATTCTCCTGCTGTTTC. 3. I odwrotny 5. CTCATGCAGGAAGGTCAGCy3.) W celu powielenia fragmentu transgenu o długości 750 par zasad
[hasła pokrewne: dyżury aptek krapkowice, cards against humanity allegro, apteka andrychów dyżur ]