sadzenie kiełków marihuany

Skrawki skóry noworodków myszy inkubowano z NE w 37 ° C przez 0 godzin (a), 6 godzin (b), 12 godzin (c) lub 24 godziny (dś, h) i zbadano przez barwienie H & E. Odstępy skórno-naskórkowe obserwowano od 6 godzin po inkubacji. Separacja skórno-naskórkowa była blokowana przez inhibitor NEA Mucuc-AAPV-CK (f) i antygen mBP180ABC (g), ale nie przez inhibitor CG / chymazy Z-GLF-CK (h). Skrawki inkubowane w pożywce bez NE nie wykazywały rozdzielenia skórno-naskórkowego (e). Miejsce podstawowych keratynocytów (strzałka), pęcherzyk (v). × 400. NE degraduje ektodomenę rekombinowanego mysiego antygenu BP180 in vitro. Aby określić, czy NE jest w stanie bezpośrednio degradować antygen BP180, ustalamy testy degradacji in vitro przy użyciu rekombinowanego białka fuzyjnego 42 kDa, GST-mBP180ABC (Figura 8a) jako substratu dla NE. Jak pokazano na Figurze 8b, gdy rekombinowaną GST-mBP180ABC inkubowano z NE, białko fuzyjne 42 kDa degradowano do 3 różnych mniejszych fragmentów o masach cząsteczkowych 34, 29 i 26 kDa, jak określono za pomocą SDS-PAGE (Figura 8b). , ścieżki 2-5). Nie zaobserwowano produktów degradacji w próbce reakcyjnej nie zawierającej NE (Figura 8b, ścieżka 6) lub zawierającej NE w 0 godzinie (Figura 8b, ścieżka 1). Rekombinowany GST był oporny na trawienie NE (Figura 8b, ścieżka 7), wskazując, że ugrupowanie GST z GST-mBP180ABC nie było celem dla NE. W celu dalszego scharakteryzowania produktów degradacji NE opisane powyżej mieszaniny trawienne poddano analizie immunoblot przy użyciu surowicy odpornościowej anty-mBP180. Przeciwciała anty-mBP180ABC znakowały 3 prążki, które zostały wykryte przez barwienie błękitem Coomassie, a ponadto znakowano 3 dodatkowe prążki 18, 15 i 9 kDa (Figura 8b, ścieżki 9. 11). Ten wzór wybarwiania immunoblotem nie był pod wpływem wstępnej adsorpcji surowicy anty-BP180 rekombinowanym GST, ale został całkowicie zniesiony przez wstępną adsorpcję z białkiem GST-mBP180ABC (stosunek molowy 5: białka fuzyjnego / IgG, dane nie pokazane). Zatem każdy z tych produktów degradacji zawierał jeden lub więcej epitopów rozpoznawanych przez antyserum anty-BP180. Wydaje się, że są co najmniej 3 miejsca cięcia NE zlokalizowane w pozakomórkowej nie-kolagenowej domenie NC14A mysiego białka BP180. Wyniki te przewidywałyby uwolnienie 110, 105 i 102 kDa z pełnej długości BP180. Przewidywany fragment o 102 kDa jest podobny do rozmiaru wykrytego w skórze zmianowej eksperymentalnego BP (Figura 6). Figura 8 Degradacja in vitro mBP180ABC przez elastazę neutrofilową. (a) Schemat jest reprezentacją strukturalną mBP180. Pionowy czarny pasek oznacza domenę transbłonową. Region zewnątrzkomórkowy z terminalem COOH składa się z 13 kolagenowych domen potrójnie spiralnych (otwarty słupek) i 14 nie-kolagenowych (wypełniony słupek). Oczyszczone rekombinowane białko fuzyjne GST-mBP180ABC ma 42 kDa, zawierające 26 kDa GST i 145-aminokwasowy fragment zewnątrzkomórkowej domeny mBP180. MBP180ABC składa się z nie-kolagenowego NC14A o wielkości 8 kDa (wypełniony słupek) i kolagenowego regionu 8 kDa (otwarty słupek). Jeden patogenny (owalny) i 2 niepatogenne epitopy (okręgi) znajdują się wewnątrz mBP180ABC (patrz odnośnik 51). (b) Białko fuzyjne GST-mBP180ABC (ścieżki 1-6, 8 A 11) lub sam GST (ścieżka 7) inkubowano z (ścieżki 1, 5, 7 <11 11) lub bez (ścieżka 6) NE w 37 ° C przez 0 minut (ścieżki i 8), 0,25 godziny (ścieżki 2 i 9), 0,5 godziny (ścieżki 3 i 10), godzinę (ścieżki 4 i 11) lub 2 godziny (ścieżki 5. 7). Produkty następnie rozdzielono przez SDS-PAGE i wykrywano przez barwienie błękitem Coomassie (ścieżki 1. 7) lub immunoblot (ścieżki 8. 11). Fragmenty o masie 34 kDa, 29 kDa i 26 kDa wytworzono z cięcia białka fuzyjnego przez elastazę (ścieżki 2 . 5 i 9. 11). Nie zaobserwowano produktów degradacji po inkubacji bez NE (ścieżka 6) [patrz też: apteka głogów dyżur, apteka brzeg dyżur, dyżury aptek krapkowice ]