turawa sinice

Próbki skóry wykorzystano do rutynowego badania histologicznego za pomocą mikroskopu świetlnego (barwienie hematoksyliną i eozyną [H & E]) i bezpośrednimi testami IF w celu wykrycia króliczych IgG i depozycji myszy C3 w strefie błon podstawnych (BMZ). Inne próbki skóry stosowano do testów enzymatycznych opisanych poniżej. Surowice wstrzykniętych zwierząt badano za pomocą pośrednich technik IF w celu określenia miana króliczych przeciwciał anty-mBP180. Bezpośrednie i pośrednie badania IF przeprowadzono w sposób opisany uprzednio (17), stosując komercyjnie dostępne sprzężone z FITC kozie anty-królicze IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., Gaithersburg, Maryland, USA). Monospecyficzną kozie anty-mysią surowicę C3 zakupiono od Cappel Research Products (Durham, North Carolina, USA). Kwantyfikacja akumulacji PMN w miejscach wstrzyknięcia przeciwciał. Aktywność MPO w tkankach była stosowana jako wskaźnik neutrofilów polimorfojądrowych (PMN) w próbkach skóry zwierząt doświadczalnych, jak opisano w innym miejscu (36). Standardową krzywą odniesienia ustalono najpierw, uzyskując poziomy aktywności na podwielokrotnościach znanych ilości oczyszczonego MPO. Próbki skóry myszy ekstrahowano przez homogenizację w buforze zawierającym 0,1 M Tris-Cl, pH 7,6, 0,15 M NaCl, 0,5% bromku heksadecylotrimetyloamoniowego. Poziom aktywności MPO w frakcjach supernatantu określono przez zmianę gęstości optycznej przy 460 nm wynikającą z rozkładu H2O2 w obecności o-dianizydyny. Zawartość MPO wyrażono jako względną aktywność MPO (> OD460nm / mg białka). Stężenie białka oznaczono za pomocą testu wiązania barwnika Bio-Rad (Hercules, California, USA) stosując standard BSA. Testy enzymatyczne dla NE i CG / chymazy. Aktywność NE w ekstraktach skórnych i neutrofilowych myszy mierzono za pomocą substratu specyficznego dla NE Met-O-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNA według Nakajima et al. (37). Aktywność CG / chymazy w ekstraktach skórnych i neutrofilowych myszy badano stosując substrat CG / chymaza Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA, jak opisał Barrett (38). Analiza zymograficzna. Profile proteinazy zostały określone przez zymografię, jak opisano wcześniej (32, 39). W skrócie, ekstrakty białkowe z neutrofili i próbki skóry ze zwierząt, którym wstrzyknięto IgG, poddano SDS-PAGE żelom akryloamidowym zawierającym kazeinę (12% akryloamidu i 1% kazeiny) lub żelu akryloamidowym zawierającym żelatynę (8% akryloamidu i 1% żelatyny) w warunkach nieredukujących. Po elektroforezie żele przemyto dwukrotnie 2,5% Tritonem X-100 przez 30 minut w celu usunięcia SDS. Następnie krótko przepłukano je H2O, a następnie inkubowano przez noc w 37 ° C w buforze reakcyjnym (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl i 5 mM CaCI2). Żele zabarwiono błękitem brylantowym 0.125% Coomassie. Aktywność kazeinolityczna i żelatynolityczna pojawiła się jako bezbarwne strefy na niebieskim tle. W celu scharakteryzowania proteinaz widocznych na zymogramach, badane próbki zmieszano z panelem inhibitorów lub rozpuszczalników kontroli negatywnej i inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej przed elektroforezą. Końcowe stężenia inhibitorów wynosiły 3 .g / ml Al-PI (H2O jako rozpuszczalnika), .g / ml MeOSuc-AAPV-CK (DMSO jako rozpuszczalnika), .g / ml Z-GLF-CK ( DMSO jako rozpuszczalnik), mM PMSF (izopropanol jako rozpuszczalnik), 5 mM EDTA (H20 jako rozpuszczalnik), 10 mM 1,10-fenantrolina (metanol jako rozpuszczalnik) i 0,1 mM chymostatyna (DMSO jako rozpuszczalnik). Po elektroforezie żele przepłukano 2,5% Tritonem X-100, inkubowano w buforze reakcyjnym i barwiono błękitem o barwie 0,125% Coomassiego, jak opisano powyżej. Wpływ inhibitorów NE i CG / chymazy. Ludzkie a-PI i A-1-ACT rozpuszczono w jałowym PBS. MeOSuc-AAPV-CK (inhibitor NE) i Z-GLF-CK (inhibitor CG / chymazy neutrofili) rozpuszczono w DMSO. Dawki tych inhibitorów wynosiły 100 .g / g masy ciała
[więcej w: atrofia szyjki macicy, apteka andrychów dyżur, przepuklina przeponowa objawy ]